对于大部分实验,各个生物公司会推出该实验的试剂盒,其中包含了此部分所有需要的试剂和特殊耗材。请按照使用说明储存各个试剂。如因意外损耗导致试剂盒中某种特定试剂不足,可向公司单独订购补充装。除此之外,对于某些成分较为简单且消耗量大的试剂,我们可以在实验室自己制备,是资金不足时的好对策。
1. DNA提取与质粒纯化
从细菌/细胞中提取 DNA 或质粒,用于后续 PCR、酶切等实验
质粒小提/大提试剂盒(Plasmid mini/maxiprep kit)
基因组DNA提取试剂盒(Genomic DNA extraction kit)
凝胶回收试剂盒(Gel extraction kit)
2. PCR
扩增目标 DNA 片段,克隆到载体中
➢ Q5 master mix
3. 酶切与链接
剪切并连接 DNA 片段,构建载体
➢ 10* T4 DNA ligase buffer
➢ T4 DNA ligase
➢ Bsal酶
4. 琼脂糖凝胶电泳
验证DNA长度,确定上一步实验是否成功
➢ 核酸染料
➢ 50*TAE buffer/TBE buffer
使用时1:50稀释,常温储存
➢ 琼脂糖(agarose)
制胶:
琼脂糖 (Agarose) 1 g
1x TAE/TBE 100 mL
微波加热至完全溶解
待温度稍降,加入核酸染料
倒入已经已经放置好底座的磨具中,插入梳子,保持水平
静待约20分钟即可使用
5. DNA转化
将构建好的质粒导入细菌,培养克隆
➢ 感受态细胞
(DH5α, BL21, Stbl3, NEB 10-beta等)
6. 培养
细菌生长、筛选阳性克隆
➢ 琼脂粉
➢ LB肉汤(或自己按营养成分配)
液体培养液配制:(按比例运算)
25g LB肉汤
1000mL 水
高温高压灭菌后使用,4度保存
固体培养基配制:(按比例运算)
5g LB肉汤
3.75g 琼脂粉
250mL 水
高温高压灭菌后,可待温度稍降,按照筛选需求加入过滤后的特定抗生素(如K抗比例为1:1000,在总量为250mL时加入250微抗生素)
铺板
标记日期及抗性,待凝固后4度保存
➢ 5*M9 minimal salt(或自己按营养成分配)
使用时需1:5稀释,并根据需求添加碳源或微量成分,4度保存
➢ 抗生素
Ampicillin/ Kanamycin/ Chloramphenicol/ Tetracycline
根据厂家说明在使用前稀释,-20度保存
➢ IPTG粉末
配制:
IPTG 23.8 g
超纯水补足至 100 mL
过滤除菌(0.22 µm滤膜)
-20°C 保存
7. 蛋白胶SDS-PAGE
验证蛋白表达等
➢ SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒
➢ Loading buffer
➢ DTT还原剂
请根据生物公司提供的protocol处理蛋白样本