合成引物
PCR
PCR 反应体系（50 µL）：
目的片段 10ng
上游引物（10μM） 2μl
下游引物（10μM） 2μl
2×Mix 25μl
ddH2O up to 50μl
PCR 反应程序（三步法）：
98℃ 预变性 30 s，
35 recycles：98℃ 10 s，54℃ 5 s，72℃ 15 s
72℃ 1 min
4℃ 保持
（体系，温度请根据引物Tm或说明进行调整）
琼脂糖凝胶电泳检测
取扩增后DNA产物样品，120V恒压电泳20~30min，保存电泳图片。（若电泳池内1×TAE缓冲液无法没过琼脂糖凝胶时，请补充1×TAE缓冲液至没过凝胶。电压增大会使DNA电泳速度增快，但最大电压切勿不可超过160V，否则会造成DNA拖尾或DNA破碎。琼脂糖凝胶的配制：1×TAE缓冲液+琼脂糖，微波炉中加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下，加入核酸染料混匀，倒胶。其中琼脂糖含量为1g/100mL，核酸染料含量为10μL/100mL）
PCR产物纯化
请遵照您使用的试剂盒的说明书
质粒DNA的制备
请参照您使用的质粒提取试剂盒说明书
*特别提示，洗脱液适合长期保存DNA，但可能会影响接下来的反应。可以使用65℃dd水洗脱。 为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
酶切质粒及目的基因
目的基因酶切反应体系（50 µL）：
10×GreenBuffer 5 µL
酶切酶1 2.5 µL
酶切酶2 2.5 µL
目的基因 x µL x= 2500/回收产物浓度
(两种酶每1ul对应酶切1000ng目的片段或质粒)
ddH2O补足至 50 µL
反应体系在 37℃水浴 30min，85℃金属浴灭活10min
酶切产物纯化请参照试剂盒说明书
载体酶切反应体系（50 µL）：
10×Buffer 5 µL
酶切酶1 2.5 µL
酶切酶2 2.5 µL
质粒 x µL x=2500/回收产物浓度
(两种酶每1ul对应酶切1000ng目的片段或质粒)
ddH2O补足至 50 µL
反应体系在 37℃水浴 30min，85℃金属浴灭活10min
酶切产物纯化请参照试剂盒说明书
目的基因与质粒载体的连接
1 目的片段与载体片段使用量的计算：
| 载体 | 目的基因 | |
|---|---|---|
| 长度 | x kb | y kb |
| 浓度 | k ng/μl | m ng/μl |
| 单位体积摩尔比 | k/x | m/y |
| 上样摩尔比 | 1 | 5 |
| 上样体积比 | z | a |
计算方法为z+a=17,kz/x:ma/y=1:5
2 利用 T4 DNA ligase 连接酶连接双酶切后的质粒和目的基因，反应体系如下：
质粒-目的基因（20 µL
目的 DNA 片段 a μl
载体 DNA z μl
10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL
T4 DNA Ligase 1μL
4℃ 过夜酶连或22℃水浴连接30min
转化
第2，5，6，7步应当在超净台中操作，且5，6，7步应当点燃酒精灯，在灯焰前方区域操作。
1 取1管DH5α感受态细胞，放在冰上融化；
2 每100μL感受态细胞加入约10μL连接产物（目的DNA的体积不要超过感受态细胞悬液体积的 1/10），用移液器轻轻吹吸混匀，在冰上放置30min；
3 热击：将离心管放置42℃水浴中，热击90s，注意：勿摇动离心管；
4 冰浴：快速将离心管转移至冰浴，放置2-3min；
5 复苏：每管感受态细胞内加入600μL 无菌无抗的LB液体培养基，在37℃摇床内180rpm振荡培养1h；
6 离心：3500rpm离心10min，去600ul上清液，使用移液器重悬菌液
7 涂布：取100μL复苏后细胞均匀涂布于含抗生素的LB平板，涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新的平板；
8 培养：待平板上涂布液体完全吸收后，将培养皿倒置，放入37℃恒温培养箱中12~16h后观察菌落。
测序
挑取单克隆后通过试剂盒提取DNA，取35μL使用载体通用引物测序
转化至表达菌株
1 取1管BL21感受态细胞，放在冰上融化；
2 每100μL感受态细胞加入约2μL的测序成功的质粒，轻轻弹动离心管壁混匀（禁止涡旋），在冰上放置30min；
3 热击：将离心管放置42℃水浴中，热击60s，注意：勿摇动离心管；
4 冰浴：快速将离心管转移至冰浴，放置2-3min；
5 复苏：每管感受态细胞内加入500μL 无菌无抗的LB液体培养基，在37℃摇床内250rpm振荡培养1h；
6 涂布：3500rpm离心5min后，弃500μL，重悬菌体后将剩余菌液全部均匀涂布于含由抗生素的LB平板；
7 培养：待平板上涂布液体完全吸收后，将培养皿倒置，放入37℃恒温培养箱中12~16h后观察菌落。
蛋白诱导表达小试
1 活化菌种：挑选单个克隆接种于含有抗性的LB小管中，37℃，220rpm摇床培养过夜；
2 取出 600 μL 菌液加入 400 μL 50%甘油中，做好标记，放至-80 ℃低温中保存；
3 转接： 取100µL过夜菌液接至含有抗性的LB小管中，然后37℃，220rpm摇床培养约3-4h；
4 取300μL菌液标记为“诱导前”。剩余菌液 16 ℃，220 rpm 降温 1 h，然后在超净台内加入5 μL IPTG（1 M）诱导大肠杆菌产生目的蛋白。16 ℃，220 rpm 过夜培养 12 h。取300μL菌液标记为“诱导后”（如诱导失败可尝试37℃诱导，IPTG也可以拉梯度进行诱导）
5 将诱导前和诱导后菌液12000rpm离心1 min ，弃上清将菌体加入200μL 1×PBS混匀后， 12000rpm离心1min；
6 上清吸至新的EP管中，标记为“上清”，沉淀加入200ul 1×PBS，混匀，标记为“沉淀”；分别往上清、沉淀样品中加入50uL还原性 5×loading buffer，轻摇混匀，勿上下颠倒，然后煮样，（放到设置好条件的金属浴上，100℃，15min），电泳检测。
蛋白诱导表达
1 活化菌种：取5μL之前保存好的含重组质粒的BL21甘油菌，接种于含有抗性的LB小管中，37℃，220rpm摇床培养过夜；
2 将菌液倒入含有 250 mL LB培养液的 500 mL 锥形瓶中，加入 100 μL Kana（100 mg/mL）。37 ℃，220 rpm 在摇床中培养 5 h，待菌液变浑浊后 16 ℃，220 rpm 降温 1 h，然后加入250 μL IPTG（或先前实验的最佳浓度）诱导大肠杆菌产生目的蛋白。使用之前测试的最佳温度，220 rpm 过夜培养 12 h；
3 将菌液 4000 rpm，4℃离心 20 min，弃上清，将沉淀的大肠杆菌用药匙转移到烧杯中，并用悬菌buffer重悬，加入溶菌酶使终浓度为0.1 mg/ml；
4 将重悬菌液在4℃下用高压细胞破碎机破碎，得到的混合物用高速离心机在4 ℃，18000 rpm条件下离心 30 min，取上清与镍介质一同在4℃下孵育1.5 h后，用洗杂buffer（Buffer+拉梯度咪唑，每次使用考马斯蓝验证至无杂蛋白）洗去杂蛋白。用洗脱buffer（Buffer+拉梯度咪唑）洗脱目的蛋白。洗杂洗脱期间均用G250验蓝；
5 用 10 kD 的超滤浓缩管盛装洗脱下来的蛋白质溶液，在离心机中 4 ℃，3400 rpm 离心，并用悬菌buffer进行换液，得到蛋白溶液；
6 用紫外分光光度计在280nm条件下测定蛋白质浓度。